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    卓越電鏡技術,助全球首次成功拍攝自噬圖——訪2016諾貝爾生理醫學獎核心成員馬場美鈴研究員

    儀器信息網 2019/06/04 10:00:38 點擊 990 次
    賽多利斯
    [導讀] 馬場美鈴老師作為本次獲獎課題研究的核心人物,深受業界人士的關注。她是如何掌握電子顯微鏡技術,最終研發出酵母獨特的快速冷凍置換固定法?還有,她對電鏡觀察的執著與熱情來源于什么?

      日本分子細胞生物學家,東京工業大學榮譽教授大隅良典(Yoshinori Ohsumi)榮獲2016年諾貝爾生理學或醫學獎,以表彰其在研究自噬性溶酶體方面作出的貢獻。

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      馬場美鈴老師作為本次獲獎課題研究的核心人物,深受業界人士的關注。她是如何掌握電子顯微鏡技術,最終研發出酵母獨特的快速冷凍置換固定法?

      還有,她對電鏡觀察的執著與熱情來源于什么?

      為了找到這些問題的答案,我特地前往工學院大學八王子校園內的實驗室,采訪了馬場美鈴博士。

    捕捉自噬現象的決定性瞬間

    ——憑借卓越的電鏡技術,全球首次成功拍攝自噬圖


      原文標題オートファジー現象の決定的瞬間を捉えて——卓越した電子顕微鏡技術が世界初の撮影を成功させる

      采訪·文山田一郎,大塚智惠

      中文編輯:蔣雪 (儀器信息網授權發布)


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    工學院大學 綜合研究所 研究員 馬場美鈴 博士

     從一開始覺得有趣到不斷探索電子顯微鏡   

      2016年,大隅良典(東京工業大學榮譽教授)因“在細胞自噬機制方面的發現”獲得諾貝爾生理學與醫學獎,馬場美鈴博士也為這一課題研究發揮了至關重要的作用。之所以這么說,是因為馬場博士的電子顯微鏡技術是大隅教授能夠在自噬研究方面作出突破的基礎。

      在日本女子大學上學時,馬場博士第一次接觸電子顯微鏡。她學的是家政學專業 家政理學系(理學部前身),大二的時候輔修了大隅正子教授的電子顯微鏡課。“通過電子顯微鏡觀察動物細胞時,真的很意外,沒想到細胞里面這么漂亮,我很開心,也非常感動”。

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      此后,馬場博士開始孜孜不倦的閱讀小川和郎課題組編著的“電子顯微鏡圖說細胞學”(1974年發行)。這本書上有許多動物、昆蟲、微生物、細菌等的電子顯微鏡圖像,清晰呈現了肉眼看不到的微細結構,向世人展示了微觀世界的美妙。

      由于對電鏡的濃烈興趣,大三時,馬場博士到學校實驗室當助手,幫忙制備植物細胞切片。“剛開始沒什么經驗,很難切出一個超薄的切片。所以一般我會先切,然后用電鏡看看切的怎么樣。觀察自己第一次做的切片時,我看到了很多的刀痕,但是能夠看到植物細胞壁的內部結構我還是很興奮”,似乎也正是因為電鏡的魅力,才促使她“毅然決然地選擇了電子顯微鏡的研究”。日本女子大學校有電鏡實驗室,那時,馬場博士一邊做生物學的研究,一邊跑電鏡實驗室,開啟了電鏡研究的日常。“當時實驗室電鏡設備一應俱全,所以可以說我是十分幸運的。除了透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)外,還有冷凍復型電鏡、冷凍切片機。實驗室買了新設備,我都會學著用,慢慢學到的東西也越來越多。”

      馬場博士卓越的操作技術,是她日積月累的成果。她鍥而不舍,反復練習,才真正掌握了切片、冷凍復型、冷凍切片等技術。而且她還經常參加儀器培訓。比如,在報名參加某個培訓時,只有兩個人,一個就是馬場博士。一般的大會只是泛泛而談,但這種培訓會講的十分詳細,鏡筒都會拆卸很多次。她熟讀本陣良平著作的“醫學生物學電子顯微鏡入門”(1968年發行),以掌握電鏡理論。而且,電鏡實驗室的儀器出現故障時,她會緊跟在維修人員身后,觀察他們的操作,不時提出疑問,在實踐中不斷學習。她也經常參加學術會議,與時俱進,學習新技術。她思維敏捷,洞察力強,能快速抓住要點。在日積月累的學習中,掌握了卓越的電鏡技術。

     成功開發快速冷凍法,可觀察酵母的超微結構   

      酵母獨特的快速冷凍置換固定法的研發成功,彰顯出馬場博士的電鏡技術實力。當時,她一直在使用電鏡觀察真菌微生物--酵母,探究其微細結構。實驗中發現:對于菌類細胞微細結構的觀察,最大的問題是固定組織標本。觀察運動細胞中的細胞器等物質時,必須要固定組織標本才可以正常觀察。“市川老師課題組從10多年前就開始使用快速冷凍法對動物細胞標本進行固定,由此拍攝了很多電鏡圖像。但是,類似酵母這樣的真菌細胞會受到細胞壁干擾,即使采用Heuser型金屬接觸法(動物細胞處理方法),觀察效果還是欠佳。而且如果不破壞細胞壁,固定液就無法進入到細胞內,所以我覺得這個實驗可能注定要失敗了”

      就在這個關鍵節點,以田中健治(當時名古屋大學醫學部附屬醫真菌研究機構教授)為代表的酵母細胞研究會,迫切需要一種快速冷凍方法。由于當時Howard,R.J. 和Aist,J.R. 已成功研發出快速冷凍線狀真菌的方法,研究會鄭重邀請其中一人,在日本舉辦了研討會。田中教授和日本女子大學的研究員(小堀博美)參加了那場研討會,并收獲良多。但是,酵母和線性真菌的細胞壁性質不同,更不好處理,實驗進展不太順利。

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      “于是我嘗試將細胞壁切開,夾成“三明治”。把酵母細胞夾在兩個銅板之間,浸入冷卻保護劑中,使之快速冷凍,然后切割破壞細胞壁,將組織標本浸入鋨酸(OsO4)溶液內,如此反復多次。最終成功研發出冷凍復型方法。核糖體也有細胞壁,當拍攝到細胞內清晰的結構時,我非常興奮。當時也是別無他法,我才嘗試溶解細胞壁,破壞核糖體,提取細胞組織。當然這些都寫進論文里了”

      1987年,酵母獨特的快速冷凍置換固定法別名“夾心法”誕生了。自此之后,電子顯微鏡可以觀察到酵母細胞的整體形貌,但這需要操作人員熟練掌握操作技巧。1990年前后,全世界僅有3個人能夠用這種方法成功觀察酵母細胞。其中一人,自不必說,當然是經過諸多波折研發出這種新方法的馬場博士本人。

     自噬研究源于“想要觀察”    

      馬場博士一直努力鉆研電子顯微鏡技術,逐漸她開始渴望更深入的研究。于是她辭去日本女子大學的工作,1988年進入工學院大學,專注于科學研究。那之后她經常到大隅良典的駒場實驗室做技術交流,當時大隅良典剛升為東京大學教養學部的副教授。大隅教授曾將分離的液泡送至日本女子大學進行冷凍復型處理,隨后不久,大隅教授和馬場博士二人便開始一起進行科研項目研究。“日積月累,我掌握的技術越來越多,于是我開始不滿足于現狀,就在這時聽說大隅教授建了駒場實驗室。剛開始,兩個人只是討論一起寫的論文。后來,我會用電子顯微鏡來驗證一些假想,隨著研究思路和方向日漸清晰,我覺得實驗過程也變得十分有趣,而且令人沉迷。所以,我連歌手荒井由美結婚了都不知道(笑)。我一心撲在研究上,不太關注其他事情”

      大隅教授主要研究酵母菌液泡的物質輸送。液泡可儲存細胞內的有機代謝產物,它和溶酶體一樣均含有分解酶,所以推測液泡應該具備分解作用。使用光學顯微鏡觀察饑餓狀態的酵母細胞,我們發現液泡內堆積著很多圓形顆粒。

      “但是,光學顯微鏡的分辨率低,很難捕捉到顆粒的內部結構。“想要看看這到底是什么”。因為大隅教授的這句話,開啟了自噬機制研究”。大隅教授與桂勛(現國立遺傳學研究所所長)成立了共建實驗室,實驗室有光學顯微鏡,走廊還放了一臺細胞培養裝置。據馬場博士回憶,如果拿“宇宙時代”比喻當時日本女子大學的設備等級,那駒場實驗室就是“石器時代”。“大隅教授一探究竟的想法很強烈。最初大隅教授通過溶解酵母細胞壁,形成原生質體,然后向細胞組織內注入鋨酸,采用常用的固定法觀察了組織細胞。他當時說道,“即使污染標本也沒關系,想用電鏡觀察看看”。觀察時,液泡內一片漆黑。所以只能通過快速冷凍處理組織切片。但是,駒場實驗室沒有固定時所用的細胞冷凍裝置。他拿著自己畫好的圖紙,讓本鄉的工廠照圖生產。”

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     世界首次成功拍攝自噬的電鏡圖    

      工廠生產的小型細胞冷凍裝置雖然沒有溫控功能,但只要具備熟練的操作技巧和豐富的專業知識,就能成功冷凍細胞。但是,快速冷凍酵母細胞對于馬場博士來說也是一道難關。因為饑餓狀態的酵母細胞,細胞壁會變厚,液泡體積增大。“液泡和細胞質不同,含水量多,宛如水中漂浮的顆粒。在低溫冰凍過程中液泡會迅速形成冰晶,難以切出結構完整的組織切片,而且產生的冰晶會損傷細胞的內膜系統。很難做到細胞冷凍狀態剛剛好,我嘗試很多次都失敗了。而且,切割標本時,刀需要正對標本,制備超薄切片要步步嚴謹,整個標本制備的過程必須全神貫注。”

      歷經諸多波折,馬場博士終于找到快速冷凍酵母細胞的方法。并于1989年拍攝到自噬現象的電鏡圖像,成為世界第一人。“拍到的圖片真的是太漂亮了。顆粒是圓形的。從這張圖上可以清晰地看到被細胞膜包圍的細胞質。當大隅教授看到(運動的顆粒正是)細胞質時,他激動地說道‘用它可以寫兩篇論文了’”

      事實上圖像拍攝也蘊含了很多技術含量,比如,冷卻速度需在1秒內冷卻到10,000°C以下,當然這些鮮為人知。想要獲取清晰圖像可不是那么輕松的。

      馬場博士之所以能取得這一輝煌成就,是因為她在工學院大學夜以繼日地鉆研和努力。實驗中使用的儀器就是日立生產的高分辨電鏡H-500H。拍攝完圖像后還要寫總結報告,據悉她有時將近3個月都呆在實驗室里。日立生產的電子顯微鏡不單單對工學院大學,對其他高校的研究也發揮了重要的作用。“日立集團旗下的日制產業(日立高新技術前身)在市谷建立了實驗室,我還借用過那里的H-7000或H-7100。很可惜現在不能租借了,而且最難得的是,以前用戶可以免費使用一整天。當時拍攝的圖像作為抑制性細胞被刊載在獲獎論文中”

      她這樣總結電子顯微鏡對自噬研究作出的貢獻。“毫不夸張的說,細胞質的發現開啟了自噬研究的大門。這是第一步。第二步,通過快速冷凍置換固定法觀察標本,清晰觀察到膜動態,推動了酵母自噬體的研發進程。反復實驗證實了液泡內的機制。根據生物化學方法無法觀察到自噬體和液泡膜融合的過程,而通過電鏡可以清晰捕捉到自噬體進入液泡的瞬間,這是電鏡獨有的特點。而且圖像極其清晰,其他實驗室做不到。”

      自噬機制是指液泡與自噬體融合形成溶解酶,降解不需要的蛋白質,重新生成生命活動所需的蛋白質。兩年后大隅教授將這一發現寫入論文,但大隅實驗室對于自噬研究的腳步不曾停止。1996年馬場博士因“酵母自噬的形態學研究”,被授予博士(理學)學位。

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    左:細胞在饑餓狀態下,自噬體(細胞質)進入液泡內

    右:自噬體遭到破壞時,細胞吸收液泡內的營養物質

     挑戰尚未解開的無數自噬謎題    

      2016年10月3日大隅良典教授榮獲諾貝爾生理學或醫學獎。2015年就是日本人榮獲這一殊榮,所以馬場博士覺得“今年希望渺茫”,甚至她都忘了頒獎這么重要的日子。共同參與自噬項目研究的馬場則男,當接到報社記者打來的電話時,十分意外,慌張地打開電視,看到大隅教授正在接受記者采訪。

      “她發言時還提到我的名字。科研就是這樣的,身邊的人得獎,所以我做的相關研究也受到了關注,但是我當時并沒有那么興奮,反而十分冷靜,感觸倒是很多。隨后,我接受了記者采訪。隨著時間的沉淀,我越發感覺到這個獎項的分量。”

      自噬研究始于1988年,歷經28年才得此殊榮。目前馬場博士正在和自噬期刊主編(國外科研學者)合作,共同研究自噬現象。

      “有時我們可以捕捉到細胞變化的決定性瞬間。所以,研究人員要保持好奇心,善于發現,這非常重要。自噬體膜會被溶酶體釋放的各種酶破壞,因此很難被檢測到。當然我們也曾苦惱于看不清膜結構,究其原因也無人知曉。前方的路未知,腳踏實地大膽探索,才能走出一條成功路。我一直秉承著這種工作態度。

      自噬實則是一種細胞自身成分降解和循環的基本過程,據說帕金森病等神經退行性疾病就受自噬效應影響。因此這一發現對于未來醫療發展具有深遠的意義。引一句大隅教授的話,“目前我們對自噬現象的了解只有30%。”馬場博士也提到:“自噬體膜的起源尚未可知,而且目前我們對于變異株的了解也只是皮毛,所以未來的路任重道遠”。為揭開基礎領域的面紗,馬場博士利用電子顯微鏡專心研究自噬形態學,日復一日年復一年,從未放棄。

      

         編者按   

      00.jpg馬場博士直言相告道,“前方的路未知,腳踏實地大膽探索,才能走出一條成功路”,想必這句話能引起不少讀者的共鳴吧。不論是什么行業,那些勇于探索未知的人大抵都懷著同樣的氣魄,不斷嘗試開辟一條新路。由于史無前例,毫無借鑒經驗參考,所以經常會碰壁,盡管如此他們還是一往無前。這份動力大概源于“熱愛”吧。

      在舊刊號INTERVIEW Vol.6的影像結尾小泉秀明如是說道。馬場博士用事實向我們證明了“只要你滿懷熱愛,就算周圍人反對也一定會堅持到底,以及一個優秀的團隊是創新的重要基石”。SI NEWS特輯也迎來了“INTERVIEW”系列第7版。我十分敬佩老師們志存高遠和堅持不懈的努力精神,每每看到這些,我都備受鼓舞,充滿干勁。SI NEWS今后將繼續努力為您傳播正能量。由于某些原因本期分兩次采訪。

    [來源:儀器信息網]
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    編輯: 楊厲哲
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